用臭氧水浸泡和噴霧方法殺滅沙門氏菌的研究

        臭氧 (O3) 是家禽加工業(yè)中一種有吸引力的替代抗菌劑。對改善食品安全問題的 O3 很佳操作條件知之甚少。因此，本研究的主要目的是使用順序浸泡和噴灑方法來表征在不同操作條件下對高沙門氏菌污染雞腿的微生物殺滅能力。將四百四十八根雞腿（280-310 g）浸泡在兩株沙門氏菌混合物中，皮膚表面的初始負(fù)荷為 6.9-log10 細(xì)胞形成單位（CFU）/cm2 [95% 置信區(qū)間（ CI），6.8-7.0]。然后將受污染的鼓槌依次（10 倍）浸泡并噴灑 O3 水溶液（8 ??ppm）和 O3-LA。在 O3 暴露后，使用 3MTM PetrifilmTM 快速需氧計數(shù)板 (RAC) 和讀板器對每個鼓槌的浸泡后和噴灑后的水、皮膚表面和皮下 (SC) 進(jìn)行定量細(xì)菌培養(yǎng)。水性 O3/循環(huán)對皮膚表面的平均殺滅能力為 1.6-log10/cm2（95% CI，1.5-1.8-log10/cm2）和 1.2-log10/cm2（95% CI，1.0-1.4-log10/cm2） ), 浸泡和噴灑方法的 SC 分別為 1.1-log10/cm2 (95% CI, 0.9–1.3-log10/cm2) 和 0.9-log10/cm2 (95% CI, 0.7–1.1-log10/cm2),分別。使用 8 ppm 的臭氧水進(jìn)行六次連續(xù)浸泡和七次連續(xù)噴灑循環(huán)，將沙門氏菌的重載量分別降低到皮膚表面和鼓槌 SC 的可檢測極限以下。添加 LA 似乎增加了 O3 水溶液的微生物殺滅能力，使用浸泡和噴灑方法在皮膚表面的平均差異分別為 0.3-log10/cm2 (P = 0.08) 和 0.2-log10/cm2 (P = 0.12)。含水 O3 不會引起鼓槌皮膚顏色的任何顯著變化。 < 4.5-log10/cm2 的沙門氏菌負(fù)荷是減少率的強(qiáng)預(yù)測因子（P < 0.001，R2 = 0.64）。這些結(jié)果提供了重要信息，有助于家禽加工設(shè)施選擇 O3 作為有效抗菌劑的很佳操作策略。

介紹

        雞肉是世界上第二受歡迎的肉類，占肉類總產(chǎn)量的 30%，其次是豬肉，占肉類總產(chǎn)量的 38%。在美國，禽肉是很受歡迎的消費(fèi)肉類，近年來消費(fèi)量穩(wěn)步增長。人均年禽肉消費(fèi)量從 1970 年的 27 磅增加到 2005 年的 60 磅（國家雞肉委員會，2011 年）。這種肉類受歡迎的原因是具有競爭力的價格、沒有文化和宗教障礙、制作速度快、脂肪含量低以及營養(yǎng)價值高（聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織 [FAO]，2014 年）。多年來，雞肉市場已經(jīng)從整只雞變成了雞塊。在過去的幾十年中，83% 的肉雞作為整只雞銷售，而 15% 作為部分銷售。 2009 年，12% 的肉雞作為整雞食用，42% 作為部分食用（國家養(yǎng)雞委員會，2011）。雞肉由于含水量高、大量可變營養(yǎng)素和高 pH 值導(dǎo)致產(chǎn)品保質(zhì)期短而支持細(xì)菌生長（Lawrie，1998 年）。在過去的幾年里，消費(fèi)者比以往任何時候都更加關(guān)注食品安全。美國農(nóng)業(yè)部、食品安全和檢驗(yàn)局 (USDA-FSIS) 的建議是控制消費(fèi)者很常購買的產(chǎn)品中的病原體流行率（美國農(nóng)業(yè)部、食品安全和檢驗(yàn)局，2015 年）。新標(biāo)準(zhǔn)包括在冷藏線末端和切割間培養(yǎng)食源性病原體（美國農(nóng)業(yè)部、食品安全和檢驗(yàn)局，2015 年）。

        在美國，食源性疾病每年導(dǎo)致 800 萬例病例、128,000 人住院和 3,000 人死亡（疾病控制和預(yù)防中心，2011 年）。根據(jù)增強(qiáng)型疾病成本模型計算的疾病年度經(jīng)濟(jì)總負(fù)擔(dān)為 777 億美元（Scharff，2012 年）。沙門氏菌是美國很常報告的食源性疾病原因，每年約有 120 萬例病例，約 20,000 人住院，約 400 人死亡（Scallan 等，2011）。包括醫(yī)療費(fèi)用和生產(chǎn)力損失在內(nèi)的年度總成本估計約為 33 億美元（Hoffmann 等人，2012 年）。沙門氏菌是很常見的與禽肉和禽肉制品相關(guān)的病原體（Hoffmann 等，2012）。因此，它被認(rèn)為是家禽加工設(shè)施衛(wèi)生條件的良好指標(biāo)（Kottwitz 等，2010；Silva 等，2010；Jakobsen 等，2012）。當(dāng)微生物數(shù)量達(dá)到 106-109 個細(xì)胞形成單位 (CFU)/cm2 時，雞胴體被認(rèn)為變質(zhì)或變質(zhì)（Russell，2001 年）。因此，安全消除或至少降低到安全水平是家禽加工設(shè)施面臨的直接挑戰(zhàn)。目前，在屠體加工過程中，通過結(jié)合使用熱處理、水和化學(xué)抗菌劑（如過氧乙酸 (PAA)）來去除或控制細(xì)菌污染（Northcutt 等人，2005 年；Dittoe 等人，2019 年）。然而，這些化學(xué)抗菌劑面臨著挑戰(zhàn)，包括持續(xù)數(shù)小時，其中大多數(shù)在分解前后都可能有毒（Megahed 等，2018a，b，2019）。此外，這些化學(xué)抗菌劑會產(chǎn)生不希望的顏色和質(zhì)地效果，并產(chǎn)生異味（Qiao et al., 2002）。因此，使用具有高殺滅能力、短半衰期和分解為無毒分子的其他抗微生物劑是家禽業(yè)的優(yōu)先目標(biāo)。

        在美國，食源性疾病每年導(dǎo)致 800 萬例病例、128,000 人住院和 3,000 人死亡（疾病控制和預(yù)防中心，2011 年）。根據(jù)增強(qiáng)型疾病成本模型計算的疾病年度經(jīng)濟(jì)總負(fù)擔(dān)為 777 億美元（Scharff，2012 年）。沙門氏菌是美國很常報告的食源性疾病原因，每年約有 120 萬例病例，約 20,000 人住院，約 400 人死亡（Scallan 等，2011）。包括醫(yī)療費(fèi)用和生產(chǎn)力損失在內(nèi)的年度總成本估計約為 33 億美元（Hoffmann 等人，2012 年）。沙門氏菌是很常見的與禽肉和禽肉制品相關(guān)的病原體（Hoffmann 等，2012）。因此，它被認(rèn)為是家禽加工設(shè)施衛(wèi)生條件的良好指標(biāo)（Kottwitz 等，2010；Silva 等，2010；Jakobsen 等，2012）。當(dāng)微生物數(shù)量達(dá)到 106-109 個細(xì)胞形成單位 (CFU)/cm2 時，雞胴體被認(rèn)為變質(zhì)或變質(zhì)（Russell，2001 年）。因此，安全消除或至少降低到安全水平是家禽加工設(shè)施面臨的直接挑戰(zhàn)。目前，在屠體加工過程中，通過結(jié)合使用熱處理、水和化學(xué)抗菌劑（如過氧乙酸 (PAA)）來去除或控制細(xì)菌污染（Northcutt 等人，2005 年；Dittoe 等人，2019 年）。然而，這些化學(xué)抗菌劑面臨著挑戰(zhàn)，包括持續(xù)數(shù)小時，其中大多數(shù)在分解前后都可能有毒（Megahed 等，2018a，b，2019）。此外，這些化學(xué)抗菌劑會產(chǎn)生不希望的顏色和質(zhì)地效果，并產(chǎn)生異味（Qiao et al., 2002）。因此，使用具有高殺滅能力、短半衰期和分解為無毒分子的其他抗微生物劑是家禽業(yè)的優(yōu)先目標(biāo)。

        臭氧 (O3) 以其強(qiáng)氧化能力而聞名，其氧化電位為 2.07 V，幾乎是氯的氧化電位 (1.36) 的兩倍，并且高于 PAA (1.81) 的氧化電位 (Russel 等人，1999)。由于 O3 具有很強(qiáng)的氧化電位，即使在濃度低至 0.01 ppm 的情況下，O3 對細(xì)菌也具有很強(qiáng)的毒性（Qingshi 等人，1989 年）。此外，O3 對家禽產(chǎn)品的很終外觀沒有任何負(fù)面影響（Mancini 和 Hunt，2005）。 2002 年，美國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn) O3 作為用于肉類和家禽生產(chǎn)的安全和合適的成分（美國農(nóng)業(yè)部，2002）。 1979 年，Yang 和 Chen 報道，在 2.48 ppm 的臭氧水中浸泡 9 分鐘，雞脖子上的微生物減少約 3-log10（Yang 和 Chen，1979）。在另一項(xiàng)研究中，臭氧水在暴露時間為 45 分鐘的含 3.0-4.5 ppm O3 的水中冷卻的雞胴體上沒有顯示出顯著的微生物減少率（1-log10）（Sheldon 和 Brown，1986 年）。這表明O3水溶液對沙門氏菌污染雞胴體的微生物殺滅能力仍是一個懸而未決的問題。在潛在的去污方案中，有機(jī)酸溶液和氧化劑的混合物已經(jīng)對家禽產(chǎn)品進(jìn)行了評估，并顯示出不同的結(jié)果。乳酸 (LA) 和 PAA 的組合可將鮮切葉菜中的大腸桿菌 O157 和有機(jī)物質(zhì)降低到安全水平（Haute 等人，2015 年）。據(jù)我們所知，沒有研究評估 O3-LA 的組合用于降低雞切塊中的病原體流行率和水平。因此，本研究的主要目的是使用順序浸泡和噴灑方法來表征不同操作條件下水性 O3 和 O3-LA 混合物對被高沙門氏菌污染的雞腿的微生物殺滅能力。我們還假設(shè)細(xì)菌負(fù)荷對 O3 水溶液的微生物殺滅能力有顯著影響（Megahed 等人，2018a，b）。因此，次要目標(biāo)是使用分段線性回歸來確定皮膚表面微生物負(fù)荷對含水 O3 的微生物殺滅能力的影響。

臭氧發(fā)生器

        濃度為 8 ppm 的水性 O3 是使用如我們工作中先前所述制造的 OOG1 × 0臭氧發(fā)生器獲得的（Megahed 等人，2018a，b，2019）。

順序浸泡法

        本實(shí)驗(yàn)旨在使用多順序浸泡方法表征水性 O3 和 O3-LA 對 aSTC 嚴(yán)重污染的雞腿的微生物殺滅能力。將 50 個接種鼓槌隨機(jī)分為四組，即 O3 水溶液處理 (n = 15)、O3-LA 處理 (n = 15)、陽性對照 (n = 15) 和陰性對照 (n = 5)。陰性對照鼓槌用于檢測背景沙門氏菌的存在。用水性 O3 處理過的鼓槌依次用 500 ml 含有 8 ppm O3 的水浸泡（10 次連續(xù)洗滌），每次浸泡 4 分鐘（Megahed 等人，2018a，b，2019）。為了確保 O3 的破壞，在循環(huán)之間執(zhí)行 30 分鐘的等待時間（Hirahara 等人，2019）。用 500 ml 含有 0.3% L-乳酸（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, United States）的臭氧水依次浸泡（10 次連續(xù)洗滌）O3-LA 處理的鼓槌，暴露 4 分鐘。選擇 LA 的濃度以達(dá)到 2 至 3 的 pH 范圍，以提供很佳條件以很大化 O3 的氧化能力（Van Netten 等，1994）。 500 ml 的體積被用作足以完全覆蓋 WHIRL-PAK 袋中的鼓槌的很佳體積。臭氧水的溫度為 10-12°C。在暴露期間輕輕搖動袋子。將陽性對照鼓槌用 500 ml 高壓滅菌蒸餾水 (DW) 依次浸泡（10 次連續(xù)洗滌）相同的暴露時間。

        每個浸泡循環(huán)吸出兩毫升浸泡水并用于培養(yǎng)。將 1 毫升直接涂抹在 RAC PetrifilmTM 板上，然后將 1 毫升在 9 毫升 BPW 中連續(xù)稀釋（五倍稀釋）。皮膚表面和 SC 的大約 6 cm2 區(qū)域也在每個浸泡周期的不同點(diǎn)用無菌棉簽擦拭。每個拭子在 10 ml BPW 中洗滌，然后將 1 ml 在 9 ml BPW 中連續(xù)稀釋（三倍稀釋）。將每個稀釋液中的一毫升涂在 RAC PetrifilmTM 板上。所有 RAC PetrifilmTM 板均在 37°C 下孵育 24 小時。每個稀釋液中的一毫升也在 TSA 上生長，用于細(xì)菌鑒定，使用 MALDI-TOF 質(zhì)譜法僅確認(rèn)沙門氏菌分離物。使用自動計數(shù)器（3M Petrifilm Plate Reader；3MTM Microbiology, St. Paul, MN, United States）對菌落形成單位進(jìn)行計數(shù)。將板再孵育 2-3 天以消除受損細(xì)胞恢復(fù)的影響。為了適應(yīng)讀板器的有效讀取范圍（很大讀數(shù) < 999/板），僅使用具有 30-300 個菌落的板來計算細(xì)菌減少因子 (RF)。

用蒸餾水（灰色）、臭氧8 ppm （藍(lán)色）和臭氧-乳酸混合物（橙色）使用多順序噴涂方法。垂直的藍(lán)色虛線表示未檢測到 aSTC。

結(jié)論

        使用 8 ppm 的臭氧水進(jìn)行六次連續(xù)浸泡和七次連續(xù)噴灑循環(huán)提供了一種有效的安全方案，可將污染雞部位皮膚表面和 SC 的沙門氏菌高負(fù)荷降低到可檢測范圍以下。 在臭氧水中添加 LA 似乎可以增強(qiáng) O3 的去污能力。 細(xì)菌負(fù)荷是控制O3對雞胴體表面微生物殺滅能力的重要因素。